Sono tra i più antichi e vasti cimiteri sotterranei di Roma, si estendono lungo l'antica via Ardeatina con 17 km di gallerie su quattro differenti livelli per un totale di 150.000 sepolture e una Basilica sotterranea.
Le prime gallerie furono scavate tra il II e il III sec d.C. nella proprietà della patrizia Flavia Domitilla che, secondo la tradizione, mise a disposizione della comunità cristiana i suoi possedimenti sulla Ardeatina, seguendo una pratica allora frequente.
In origine erano costituite da nuclei indipendenti, tra i più antichi l'ipogeo dei Flavi e la regione di Ampliato. Fra questi due primi nuclei si sviluppò una grande area che in un primo tempo era indipendente. Una zona del cimitero fu probabilmente riservata ai lavoratori dell'annona, come si evince dalle pitture. In questo cimitero si trovano alcune delle più antiche pitture catacombali.